BK-FL正置熒光顯微鏡是利用特定波長的光照射被檢物體產(chǎn)生熒光進(jìn)行鏡檢的顯微光學(xué)觀測技術(shù)。近年來，由于免疫熒光在醫(yī)學(xué)研究、診斷領(lǐng)域里的廣泛應(yīng)用，F(xiàn)ISH、綠色熒光蛋白(GFP)技術(shù)分別在基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面的推廣，顯微照相、數(shù)字CCD成像技術(shù)的輔助驅(qū)動(dòng)，賦予這一傳統(tǒng)技術(shù)更新的應(yīng)用價(jià)值和生命力。
 

　　熒光現(xiàn)象有兩種：一次熒光現(xiàn)象，又稱“固有熒光”或“自發(fā)熒光”，是指經(jīng)照射后，就能發(fā)出熒光的物質(zhì)，此類物質(zhì)的化學(xué)特征是發(fā)光分子具有共軛雙鍵，π電子活動(dòng)性大。二次熒光現(xiàn)象，又稱“繼發(fā)熒光”，物質(zhì)經(jīng)照射后不能或只能部分發(fā)生微弱的熒光，這樣就需先用熒光色素標(biāo)記處理，將熒光色素標(biāo)記結(jié)合插入到不發(fā)光的活性分子中去，再經(jīng)照射才能發(fā)生熒光。熒光色素應(yīng)具備的基本條件是能與不發(fā)光分子的某個(gè)區(qū)域有特異性的牢固結(jié)合，同時(shí)不會(huì)影響被結(jié)合分子的結(jié)構(gòu)和特性，光量子效率應(yīng)≥013。
 

　　BK-FL正置熒光顯微鏡標(biāo)本制作特點(diǎn)和觀察要求
 

　　(1)載玻片：載玻片厚度應(yīng)在0.8―1.2mm之間，玻片太厚吸收光多，激發(fā)光難以在標(biāo)本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。
 

　　(2)蓋玻片：蓋玻片厚度應(yīng)約0.17mm，光潔。為加強(qiáng)激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這種特制蓋玻片的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質(zhì)(如氟化鎂)，它可以使熒光順利通過而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光可激發(fā)標(biāo)本中的熒光。
 

　　(3)標(biāo)本：組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，一般以5～20pm為宜，切片太厚可使激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察的標(biāo)本上部不能被激發(fā)。切片折疊或雜質(zhì)過多均可影響熒光的觀察。
 

　　(4)封片劑：封片劑必須無自發(fā)熒光、五色透明。加上抗淬滅劑后再用指甲油將蓋玻片四周封固，既保持蓋玻片不滑動(dòng)，又能防止抗淬滅劑蒸發(fā)。在沒有抗淬滅劑的情況下，也可使用含30%甘油的PBS，還可用甘油與0.5mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9.0～9.5)等量混合液作封片劑。
 

　　(5)鏡頭的清潔：在油鏡使用完畢后，需用擦鏡紙沾上無水乙醇或3：7的醇醚混合液輕輕擦拭。
 

　　(6)及時(shí)觀察：標(biāo)本染色后應(yīng)及時(shí)觀察，因時(shí)間過長熒光會(huì)逐漸減弱。若標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間。